Comentario sobre el análisis confirmatorio de Heparina por cromatografía de gases con detección por espectrometría de masas (GC-MS)
El informe preliminar realizado por SERVITOX entrega un análisis toxicológico sobre muestras de sangre del hospital Dr. Félix Bulnes donde establece la presencia de heparina en las muestras descritas en dicho informe mediante análisis por espectroscopia infrarroja (IR).
Como un segundo enfoque analítico con “carácter confirmatorio” plantea el análisis mediante cromatografía de gases con detección por espectroscopia de masas. Sobre este último punto quisiera comentar lo siguiente:
1.- La heparina es un polisacárido altamente sulfatado y polidisperso cuyo peso molecular promedio es de 14.000 Da y el rango natural de variación abarca desde 2.000 a 50.000 Da.
Químicamente la heparina pertenece a la familia de los glicosaminoglicanos y está compuesta por monómeros de ácidos hexurónicos (ácido L-idurónico y ácido D-glucurónico) y monómeros de glucosaminas modificados, poseen grupos sulfato unidos en los átomos de oxígeno o de nitrógeno y además están acetilados en el átomo de nitrógeno
Las figuras 1 y 2 muestran representaciones gráficas de las estructuras químicas presentes en la heparina.
Figura 1
Figura 2
De lo anteriormente expuesto y de las figuras presentadas se deduce claramente que la heparina no es una molécula simple, es altamente polar y posee cargas negativas en su estructura por lo cual evidentemente no es una molécula volátil siendo totalmente inadecuado un análisis directo por cromatografía de gases. ( condición básica para realizar análisis de cromatografía de gases es que la molécula sea volátil, o en su defecto realizar una derivatización para que una molécula no volátil se transforme en volátil).
Además la polidispersión no sólo se ve reflejada en el rango de pesos moleculares si no que también en los tipos de monómeros, grado de sulfatación y posición de los residuos sulfato que están presentes en la estructura. Se han descrito 8 disacáridos que pueden ser utilizados como marcadores de la presencia de heparina si se realiza una hidrólisis total de este tipo de molécula.
2.- Según una rápida revisión bibliográfica el enfoque actualmente utilizado para el análisis de glicosaminoglicanos como la heparina se basa en la extracción desde tejido y digestión controlada con enzimas como la heparinasa I (código EC. 4.2.27 MW 42.5 kDa), Heparinasa II (sin código EC asignado aún, MW 85.8 kDa) ó Heparinasa III (Código EC 4.2.2.8 MW 73.2 kDa) extraídas desde el Flavobacterium heparinum, luego de la digestión se realiza la separación de los extractos con diferentes grados de polimerización (es decir número de disacáridos repetidos) y su análisis por cromatografía líquida con detección por espectrometría de masa simple (LC-MS) o masa/masa (LC-MS/MS).
3.- No existe referencias bibliográficas recientes que permitan establecer la posibilidad de análisis de heparina o de los disacáridos producidos por su digestión mediante GC-MS y de ser esto factible implica necesariamente una reacción de derivatización, la cual debe ser correctamente establecida y comprobada algo que no es mencionado en el informe en comento.
4.- El informe de SERVITOX utiliza como diagnostico de masas los iones 32, 79 y 108 los cuales no corresponden a fragmentos que sirvan para el propósito antes señalado ya que la razón masa carga 32 corresponde a la presencia de oxígeno molecular por lo que jamás se utiliza como un ión importante para identificación o cuantificación en GC-MS ya que cualquier entrada de aire interferiría con el análisis en cuestión.
El ión 79 está asociado a la presencia de anillos aromáticos y es característico de la fragmentación de fenoles, tolueno y en general compuestos monoaromáticos, mientras que el ión 108 corresponde a un radical del benzaldehido. De lo anterior se deduce que ningún ión utilizado para fines “confirmatorios” es adecuado.
5.- Las distintas metodologías cromatográficas en uso para este tipo de moléculas acopladas a detección por espectrometría de masas corresponden a las siguientes:
a) Cromatografía de exclusión por tamaño (SEC size exclusión chromatoography)
b) cromatografía de intercambio aniónico fuerte (SAEC strong anion Exchange chromatography)
c) Cromatografía en fase reversa (RPLC)
d) Cromatografía de par iónico en fase reversa (RPIP)
e) Cromatografía de interacción hidrofilica (HILIC)
f) Cromatografía en carbón grafitizado (GCC)
Además se ha descrito el uso de electroforesis capilar acoplada a MS para el análisis de este tipo de moléculas. De lo anterior se deduce que existen muchas alternativas para la determinación de los disacáridos provenientes de heparina pero ninguno contempla el uso de cromatografía de gases.
6.- Los detectores de masa empleados van desde triple cuadrupolos (QqQ) pasando por sistemas híbridos de cuadrupolo y tiempo de vuelo (q-TOF) hasta sistemas de trampas orbitales (Orbitrap) ya que deben tener un rango de masas útil superior a 2000 Da para analizar los fragmentos de este tipo de polímeros y varias fuentes de ionización posibles de acoplar al detector. Los iones diagnósticos de peso molecular para este tipo de moléculas son altos de sobre 200 Da ya que mientras más alto mayor probabilidad existe de obtener el ion molecular y en base el patrón de fragmentación lograr una identificación de la molécula en cuestión.
Por lo anteriormente expuesto, se puede deducir que por la técnica analítica utilizada, NO es posible determinar presencia de un glicosaminoglicano como la heparina.
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El Autor es Bioquímico, con especialización en análisis instrumental y varios años de experiencia en el análisis de moléculas orgánicas.
